人类宫颈和阴道芯片中的宫颈粘液可调节阴道菌群失调

本研究利用器官芯片技术探索了宫颈阴道粘液在维持阴道健康方面的保护作用，尤其针对细菌性阴道病（BV）。通过构建模拟人类宫颈和阴道的芯片模型，科学家们发现，宫颈粘液能显著降低由失调菌群（如加德纳菌）引起的阴道炎症和上皮损伤。通过进一步的蛋白质组学分析，发现了与BV相关的潜在生物标志物和治疗靶点。这些发现不仅突显了宫颈粘液在维护阴道健康中的重要作用，也展示了器官芯片技术在研究女性生殖道复杂相互作用中的价值。这项研究为理解阴道菌群失调的潜在机制提供了新的视角，并为开发针对性疗法和诊断工具以提升女性生殖健康开辟了新的道路。

1、利用Emulate器官芯片，构建传统实验模型难以模拟生理结构和功能的阴道及宫颈模型，并将二者整合。

2、利用Emulate器官芯片技术，探索宫颈粘液在调节阴道微生物组组成及其对健康结果的影响。

首先，将原代人子宫成纤维细胞接种于底部通道，并在顶部通道中接种人阴道上皮细胞，从而构建出人类阴道芯片。构建人类宫颈芯片的方法类似，即将原代宫颈成纤维细胞接种于底部通道，随后在顶部通道中接种原代宫颈上皮细胞。

自宫颈芯片的上皮通道中，科学家们连续7天收集了含粘液的流出物（“宫颈芯片粘液”），随后利用阴道芯片的上皮通道进行灌注，以模拟体内生殖道中粘液的自然流动过程（图1A）。相较于不含粘液的对照组阴道芯片，含有宫颈芯片粘液的阴道芯片在多种促炎细胞因子的分泌上显示出显著降低，这些因子包括IL-1α、IL-1β和巨噬细胞炎症蛋白-1β（MIP-1β），同时，在暴露24h后，抗炎因子IL-10的产生有所增加（图1B）。这些结果表明，在体外条件下，由宫颈上皮产生的含粘液的液体能够直接影响阴道上皮，导致细胞因子的产生受到抑制，这一效应在缺乏免疫细胞的情况下依然存在。

图1：宫颈粘液对阴道芯片产生细胞因子的影响

接下来，科学家们研究了宫颈粘液对阴道芯片中菌群失调（非最佳）阴道微生物群的影响。研究方法是在阴道芯片培养的第 14 天，分别在有无宫颈芯片含粘液流出物的情况下，将含有G. vaginalis E2和E4以及P. bivia BHK8 和A. vaginae (BVC1；约10^5 CFU/芯片) 的菌群接种到阴道芯片中。结果显示，人类宫颈粘液的存在抑制了菌群在阴道上皮的定植以及其在阴道芯片上繁衍的能力。

无论是先用宫颈粘液流出物预处理阴道芯片一天后再引入微生物组，还是在引入微生物组后再添加粘液，或者在细菌接种前一日添加粘液并在随后的3天培养中持续存在，感染72小时内收集的阴道芯片上皮通道流出物中活的非粘附细菌的CFU总数（图2A）与培养结束时阴道芯片消化液中活的粘附细菌的数量（图2B）均显著减少。在宫颈粘液存在的情况下，阴道芯片上皮与菌群失调的BVC1联合体消化后，具有线索细胞样外观（即被结合细菌覆盖）的阴道上皮细胞数量减少（图2C、D）。

由宫颈粘液引起的细菌细胞数量减少现象，伴随着阴道上皮细胞活力的增加（图2E），以及促炎细胞因子IL-10、RANTES（CCL5）、TNF-α、MIP-1β和IL-1α在共培养72小时后显着下调（图3）。这些发现揭示了宫颈芯片粘液能够直接影响阴道芯片上皮，抑制炎症细胞因子的产生，这与保护阴道上皮免受损伤具有相关性。

图3：暴露于菌群失调联合体的阴道芯片产生的细胞因子

为了探究宫颈粘液是直接抑制细菌细胞生长，还是通过改变阴道细胞生理学间接抑制生长。科学家们进行了以下实验，他们比较了从对照宫颈芯片的上皮通道收集的含粘液流出物样本中阴道加德纳菌的生长情况，以及用宫颈芯片含粘液流出物灌注1天的阴道芯片流出物中培养的细菌。作为实验对照，该细菌直接在用于灌注宫颈和阴道芯片顶端通道的HBSS中培养。实验结果表明，阴道加德纳菌在宫颈芯片含粘液流出物中生长良好，但在用类似的宫颈芯片含粘液流出物灌注的阴道芯片流出物或缺乏关键营养物质的HBSS中培养时，其生长受到抑制（图4A，B）。值得注意的事，在提供最佳营养条件后进行的类似研究中，细菌生长在对照 HBSS 流出物中的生长得以恢复，但在暴露于宫颈芯片含粘液液体的阴道芯片流出物中却没有恢复（图4C、D ）。这些发现揭示了宫颈芯片产生的粘液成分能够诱导阴道芯片内壁细胞表达出抑制细菌生长的因子，从而达到抑制细菌的效果。

图4：2D培养中阴道芯片流出物中阴道加德纳菌的生长受到抑制制

为了进一步探索宫颈粘液对阴道上皮的影响，科学家们进行了质谱分析，以比较暴露于宫颈芯片流出物前后的阴道芯片与未处理的阴道芯片流出物的蛋白质组差异。研究中发现，在鉴定出的 1752 种蛋白质中，有 103 种蛋白质在流经宫颈芯片流出物的阴道芯片与单独的宫颈芯片流出物或阴道芯片流出物之间存在差异。并观察到多种蛋白质表达的显著变化，其中 64 种蛋白质表达增加（图5A），39 种蛋白质表达减少（图5B），最显著的变化以火山图突出显示（图5C）。此外，蛋白质组学数据的主成分分析（PCA）的结果也表明，与未经处理的宫颈或阴道芯片相比，暴露于宫颈芯片粘液的阴道芯片流出物中的蛋白质表达发生了显着变化（图5D）。

通过 STRING 分析，科学家们发现在 39 种下调的蛋白质中，有 3 种表现出钙通道抑制剂的活性（PHPT1、AMBP、SLC30A1）。 3 种下调的蛋白质属于脂质运载蛋白家族（AMBP、APOD、RBP4），该家族因在调节炎症和抗氧化反应方面的作用而广为人知。STRING 分析进一步揭示，17 种上调的蛋白质是 RNA 结合蛋白（RBP）。考虑到 BV 会增加对性传播感染（包括病毒感染）的易感性，这些发现进一步支持了 RBPs 可能参与在生殖道内免疫反应。此外，在阴道芯片暴露于宫颈粘液后，能够增强潜在抗菌蛋白 PLAU 和 WASF2 的表达。值得注意的是，一种显著下调的蛋白 GNS，其下调可能有助于抑制观察到的菌群失调细菌的生长，这种抑制作用是通过增加糖蛋白的硫酸化来防止粘蛋白被降解实现的。

图5：宫颈粘液改变阴道分泌物

本研究强调了宫颈粘液在维持阴道健康和预防菌群失调相关变化中的关键作用。研究结果明确表明，含有宫颈粘液的分泌物能够抑制人阴道芯片中菌群失调的生长，以及相关的炎症和上皮细胞损伤。科学家们还识别出若干蛋白质和抗菌肽，它们可以作为监测女性生殖道健康状况的临床生物标志物，并可能成为治疗阴道菌群失调的潜在靶点。

此外，这项研究揭示了外泌体在组织间通讯和对女性生殖道菌群失调的免疫保护中所扮演的潜在角色。这些发现可能具有重要的临床意义，特别是在识别具有复发性菌群失调高风险的患者，并定制其相应的治疗计划。

Emulate人体器官芯片模型为研究女性生殖道宿主-微生物组相互作用提供了宝贵的工具，并有助于识别阴道菌群失调及其他相关疾病患者的潜在临床生物标志物和治疗靶点。